MACAM PEARNAAN
Dengan metode pewarnaan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri Grampositif dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya. Oleh karena itu, pengecatan Gram tidak  bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma spContoh bakteri yang tergolong bakteri tahan asam, yaitu dari genus Mycobacterium dan beberapaspesies tertentu dari genus Nocardia. Bakteribakteri dari kedua genus ini diketahui memiliki sejumlah besar zat lipodial (berlemak) di dalam dinding selnya sehingga menyebabkan dinding sel tersebutrelatif tidak permeabel terhadap zat-zat warna yang umum sehingga sel bakteri tersebut tidak terwarnai oleh metode pewarnaan biasa, seperti pewarnaan sederhana atau Gram.Dalam pewarnaan gram diperlukan empat reagen yaitu :

Zat warna utama (violet kristal)
Mordan (larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan warna utama.
Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven organic yang digunakan uantuk melunturkan zat warna utama.
Zat warna kedua / cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai kembali sel-sel yang telahkehilangan cat utama setelah perlakuan denga alcohol.Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metodepewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelahdicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatupewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakterigram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.Pengecatan gram dilakukan dalam 4 tahap yaitu1. Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu.2. Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan mordan JKJ.3. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam.4. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safraninPerbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding selnya.Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme grampositif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucianalcohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram positif memiliki membran tunggal yang dilapisipeptidohlikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negative lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3nm).Sifat bakteri terhadap pewarnaan Gram merupakan sifat penting untuk membantu determinasi suatu bakteri. Beberapa perbedaan sifat yang dapat dijumpai antara bakteri Gram positif dan bakteri Gramnegatif yaitu:
Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu:
Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 ± 15 mm, berlapis tiga atau multilayer.
Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat didalam
lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit ± 10% dari berat kering, tidak mengandungasam tekoat.
Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.
Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet.
Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana.
Tidak resisten terhadap gangguan fisik.
Resistensi terhadap alkali (1% KOH) lebih pekat
Peka terhadap streptomisin
Toksin yang dibentuk Endotoksin
Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu:
Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer.
Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada yang sebagailapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat ringan. Mengandung asamtekoat.
Bersifat lebih rentan terhadap penisilin.
Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal.
Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit.
Lebih resisten terhadap gangguan fisik.
Resistensi terhadap alkali (1% KOH) larut
Tidak peka terhadap streptomisin

Toksin yang dibentuk Eksotoksin EndotoksinContoh bakteri gram posittif contoh bakteri gram negatif Sumber:
³ http:// id.wikipedia.org /wiki/Pewarnaan_Gram

 Pewar naan Tahan Asam
 Pewarnaan ini ditujukan terhadap bakteri yang mengandung lemak dalam konsentrasi tinggi sehinggasukar menyerap zat warna, namun jika bakteri diberi zat warna khusus misalnya karbolfukhsinmelalui proses pemanasan, maka akan menyerap zat warna dan akan tahan diikat tanpa mampudilunturkan oleh peluntur yang kuat sekalipun seperti asam-alkohol. Karena itu bakteri ini disebut bakteri tahan asam (BTA).Teknik pewarnaan ini dapat digunakan untuk mendiagnosa keberadaan bakteri penyebabtuberkulosis yaitu
 Mycobacterium tuberculosis
. Ada beberapa cara pewarnaan tahan asam, namun yang paling banyak adalah cara menurut Ziehl-Neelsen.(anonymous,2009)Bakteri Tahan Asam (pink) dan bakteri Tidak Tahan Asam (biru)Sumber: www.google.com
3
. Pewarnaan khusus untuk melihat struktur tertentu : pewarnaan flagel, pewarnaanspora, pewarnaan kapsul.

 Pewarnaan Spora
 Spora bakteri (endospora) tidak dapat diwarnai dengan pewarnaan biasa, diperlukan teknik pewarnaan khusus. Pewarnaan Klein adalah pewarnaan spora yang paling banyak digunakan.Endospora sulit diwarnai dengan metode Gram. Untuk pewarnaan endspores, perlu dilakukanpemanasan supaya cat malachite hijau bisa masuk ke dalam spora , seperti halnya pada pewarnaanBasil Tahan Asam dimana cat carbol fuschsin harus dipanaskan untuk bisa menembus lapisan lilinasam mycolic dari Mycobacterium .Skema prosedur pengecatan Spora Schaeffer Fulton

 
 Sumberhttp://images.suite101.com/400620_com_endosporestainprocpscanite.jpg Protokol pewarnaan diferensial endospores dan sel vegetatif adalah sebagai berikut:Sumber:Prinsip kerja:Spora kuman mempunyai dinding yang tebal sehingga diperlukan pemanasan agar pori-porimembesar zat warna fuchsin dapat masuk, dengan pencucian pori-pori kembali mengecilmenyebabkan zat warna fuchsin tidak dapat dilepas walaupun dilunturkan dengan asam alkohol,sedangkan pada badan bakteri warna fuchsin dilepaskan dan mengambil warna biru dari methylen blue.Cara Kerja : Dibuat suspensi kuman, ditambah dengan carbol fuchsin sama banyak. Dipanaskan selama 6 menit pada api kecil atau pada penangas air 80oc selama 10 menit. Dibuat sediaan dan dikeringkan. Dimasukkan kedalam H2SO4 1% selama 2 detik  Dimasukkan kedalam alkohol sehingga tidak ada lagi warna merah mengalir. Sediaan dicuci dengan air. Diwarnai dengan methylen blue selama 1 menit kemudian dicuci dan dikeringkan. Diperiksa dibawah mikroskop.
 Pewarnaan flagel
 Pewarnaan flagel dengan memberi suspense koloid garam asam tanat yang tidak stabil, sehinggaterbentuk presipitat tebal pada dinding sel dan flagel.
 Pewarnaan kapsul
 Pewarnaan ini menggunakan larutan Kristal violet panas, lalu larutan tembaga sulfat sebagaipembilasan menghasilkan warna biru pucat pada kapsul, karena jika pembilasan dengan air dapatmelarutkan kapsul. Garam tembaga juga memberi warna pada latar belakang. Yang berwana birugelap.
4
-Pewarnaan khusus untuk melihat komponen lain dan bakteri :
pewarnaan Neisser (granula volutin),
pewarnaan yodium (granula glikogen).
5
. Pewarnaan negatif
 TujuanMempelajari penggunaan prosedur pewarnaan negatif untuk mengamati morfologi organisme yangsukar diwarnai oleh pewarna sederhana. Bakteri tidak diwarnai, tapi mewarnai latar belakang.Ditujukan untuk bakteri yang sulit diwarnai, seperti spirochaeta
Cara pewarnaan negatif
 - Sediaan hapus

teteskan emersi

lihat dimikroskopPewarnaan negatif, metode ini bukan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnyamenjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang).Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Pada pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras dengan bahan-bahan kimia, maka terjadinyapenyusutan dan salah satu bentuk agar kurang sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan lebihtepat. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina.Pewarnaan negatif memerlukan pewarna asam seperti eosin atau negrosin.pewarna asam memilikinegatif charge kromogen,tidak akan menembus atau berpenetrasi ke dalam sel karena negative chargepada permukaan bakteri. oleh karena itu, sel tidak berwarna mudah dilihat dengan latar belakang berwarna