| Kirby-Bauer Disk Difusi Kerentanan Uji Protokol |  |  |
| Informasi |
Sejarah
Publikasi pada penisilin oleh Alexander Fleming pada tahun 1928 adalah tonggak dalam sejarah kedokteran. Sebagai senyawa antimikroba lebih banyak ditemukan, diperkirakan bahwa penyakit menular akan dihilangkan melalui penggunaan antimikroba ini (7). Sayangnya, perkembangan resistensi bakteri terhadap antimikroba ini cepat berkurang optimisme ini dan menghasilkan kebutuhan untuk dokter untuk meminta laboratorium mikrobiologi untuk menguji patogen pasien terhadap berbagai konsentrasi antimikroba diberikan untuk menentukan kerentanan atau ketahanan terhadap obat itu. Metode asli menentukan kerentanan terhadap antimikroba didasarkan pada metode dilusi kaldu (5, 7), yang meskipun masih standar hari ini, emas memakan waktu untuk melakukan. Hal ini mendorong pengembangan prosedur difusi disk untuk penentuan kerentanan bakteri terhadap antimikroba. Pada awal 1950-an, sebagian besar laboratorium mikrobiologi klinis di Amerika Serikat telah mengadopsi metode disk difusi untuk menentukan kerentanan bakteri terhadap antimikroba. Setiap laboratorium dimodifikasi prosedur yang sesuai dengan kebutuhan sendiri, termasuk menggunakan berbagai jenis media, konsentrasi inokulum, waktu inkubasi, suhu inkubasi, dan konsentrasi senyawa antimikroba. Interpretasi kerentanan dan ketahanan didasarkan hanya pada ada atau tidak adanya zona inhibisi sekitar disk, dan dua atau tiga konsentrasi berbeda dari antimikroba yang sama secara rutin diuji terhadap patogen (1). Banyak peneliti diterbitkan variasi untuk prosedur menghasilkan beberapa protokol yang mengakibatkan kebingungan meluas (1). Pada tahun 1956, WMM Kirby dan rekan-rekannya di University of Washington School of Medicine dan Raja County Hospital mengusulkan metode disk tunggal untuk pengujian kerentanan antimikroba (6). Kurangnya standarisasi untuk penentuan kerentanan bakteri terus menjadi masalah sepanjang awal 1960-an. Kirby dan rekannya, AW Bauer, luas menelaah literatur uji kerentanan. Mereka dikonsolidasikan dan diperbarui semua uraian sebelumnya dari metode difusi disk dan menerbitkan temuan mereka (2). Publikasi ini memimpin Organisasi Kesehatan Dunia untuk membentuk sebuah komite pada tahun 1961 untuk meletakkan dasar untuk pengembangan sebuah prosedur standar untuk pengujian disk yang kerentanan tunggal antimikroba (7). Hasilnya adalah sebuah prosedur standar untuk uji difusi disk yang kerentanan, untuk selanjutnya disebut Kirby-Bauer hard difusi tes (2). Saat ini, Laboratorium Klinik Standards Institute (CLSI) bertanggung jawab untuk memperbarui dan memodifikasi prosedur asli Kirby Bauer dan melalui proses konsensus global. Hal ini memastikan keseragaman teknik dan kemampuan untuk memproduksi hasil sebagai patogen mengembangkan mekanisme baru perlawanan dan antimikroba baru dikembangkan untuk melawan organisme. Pedoman interpretasi untuk ukuran zona termasuk dalam publikasi mereka (3). Publikasi CLSI, Kinerja Standar untuk Pengujian Kerentanan Disk antimikroba; Disetujui Standar Edisi 9, merupakan standar untuk laboratorium klinis melakukan uji kerentanan hari ini. Tujuan Tujuan dari tes Kirby-Bauer difusi disk yang kerentanan adalah untuk menentukan sensitivitas atau resistensi patogen aerobik dan bakteri fakultatif anaerob untuk berbagai senyawa antimikroba untuk membantu dokter dalam memilih pilihan pengobatan untuk nya atau pasien-pasiennya. Organisme patogen ditanam di Mueller-Hinton agar-agar dengan adanya berbagai antimikroba disk diresapi kertas saring. Ada atau tidak adanya pertumbuhan di sekitar disk adalah ukuran tidak langsung dari kemampuan senyawa yang menghambat organisme itu. Teori Penentuan resistensi bakteri terhadap antimikroba adalah bagian penting dari pengelolaan infeksi pada pasien. Difusi disk yang metode Kirby Bauer dan telah dibakukan dan merupakan alternatif untuk metode dilusi kaldu untuk laboratorium tanpa sumber daya untuk memanfaatkan metode otomatis lebih baru untuk pengujian kaldu microdilution. Ketika sebuah 6-mm kertas penyaring disk yang diresapi dengan konsentrasi diketahui senyawa antimikroba ditempatkan di piring Mueller-Hinton (MH) agar-agar, air segera diserap ke dalam disk dari agar-agar. The antimikroba mulai berdifusi ke dalam agar-agar sekitarnya. Laju difusi melalui agar tidak secepat laju ekstraksi keluar antimikroba dari disk, sehingga konsentrasi antimikroba paling tinggi paling dekat dengan disk dan pengurangan logaritmik konsentrasi terjadi sebagai jarak dari kenaikan disk ( 7). Laju difusi agar-agar antimikroba melalui tergantung pada sifat difusi dan kelarutan obat dalam agar-agar MH (2) dan berat molekul dari senyawa antimikroba. Molekul yang lebih besar akan menyebar pada tingkat yang lebih lambat dari yang lebih rendah senyawa dengan berat molekul. Faktor-faktor ini, dalam kombinasi, mengakibatkan setiap antimikroba memiliki zona ukuran breakpoint unik yang menunjukkan kerentanan terhadap bahwa senyawa antimikroba. Jika lempeng agar-agar telah diinokulasi dengan suspensi patogen yang akan diuji sebelum menempatkan disk pada permukaan agar-agar, pertumbuhan simultan dari bakteri dan difusi senyawa antimikroba terjadi. Pertumbuhan terjadi dengan adanya senyawa antimikroba ketika bakteri mencapai massa kritis dan dapat mengalahkan efek penghambatan senyawa antimikroba. Perkiraan waktu dari suspensi bakteri untuk mencapai massa kritis adalah 4 sampai 10 jam untuk patogen yang paling sering ditemukan, tetapi adalah karakteristik dari setiap spesies, dan dipengaruhi oleh media dan suhu inkubasi (7). Ukuran zona penghambatan pertumbuhan dipengaruhi oleh kedalaman agar-agar, karena berdifusi antimikroba dalam tiga dimensi, sehingga lapisan dangkal agar-agar akan menghasilkan zona inhibisi lebih besar dari lapisan yang lebih dalam. Titik di mana massa kritis dicapai ditunjukkan oleh lingkaran tajam marginated pertumbuhan bakteri di sekitar disk. Konsentrasi senyawa antimikroba di margin ini disebut konsentrasi kritis dan kira-kira sama dengan konsentrasi hambat minimum diperoleh dalam tes kerentanan dilusi kaldu. Zona ukuran diamati dalam uji difusi disk yang tidak memiliki makna dalam dirinya sendiri dan (7). Interpretasi dari resistensi dan kerentanan terhadap antimikroba ditentukan melalui dalam pengujian in vivo dari darah dan urin untuk menghitung tingkat diperoleh dari antimikroba diberikan yang menghasilkan resolusi infeksi. Informasi ini berkorelasi dengan ukuran zona mengakibatkan standar interpretatif. Standar interpretasi saat ini dapat ditemukan dalam Standar Standar Kinerja Klinis Laboratorium Lembaga Pengujian Kerentanan Disk antimikroba: Disetujui Standar Edisi 9 (3). Resep
sebuah
organisme Direkomendasikan untuk tujuan penjaminan kualitas adalah
Staphylococcus aureus ATCC 25923 (Biosafety level (BSL) 2), Escherichia
coli ATCC 25922 (BSL 1), dan Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 (BSL 2)
(www.atcc.org), sebagai zona inhibisi untuk organisme ini dikenal. Karena
ukuran zona dikenal karena organisme ini, mereka direkomendasikan untuk
digunakan dalam setting pendidikan, meskipun penggunaan tidak diketahui
juga harus dimasukkan ke dalam pengalaman pendidikan. Untuk
pengujian pengendalian mutu, ukuran zona untuk ketiga organisme dapat
ditemukan pada memasukkan paket dari disk apapun antimikroba yang Anda
beli.
b Pemilihan antimikroba didasarkan pada jenis organisme yang diuji dan sumber isolat (darah, urin, luka, dll). Lihat Tabel Standar Menginterpretasi untuk antimikroba disarankan untuk digunakan dalam latihan ini. Tambahan Catatan Mueller-Hinton agar-agar MH agar-agar dianggap sebagai media terbaik untuk digunakan untuk pengujian rutin kerentanan bakteri nonfastidious untuk alasan berikut: · Ini menunjukkan diterima batch-ke-batch reproduktifitas untuk uji kerentanan · Sangat rendah dalam sulfonamida, trimetoprim, dan inhibitor tetrasiklin · Mendukung pertumbuhan yang memuaskan patogen nonfastidious paling
· Sebuah tubuh besar data dan pengalaman telah dikumpulkan tentang tes kerentanan dilakukan dengan media ini (6).
Harap dicatat bahwa penggunaan media selain Mueller-Hinton agar dapat menghasilkan hasil yang salah. Juga mencatat bahwa hanya bakteri aerobik atau fakultatif yang tumbuh dengan baik pada agar MH diberi suplemen harus diuji menggunakan protokol ini. Organisme yang rewel meminta agar MH dilengkapi dengan nutrisi tambahan dan mengharuskan modifikasi untuk protokol ini harus dibuat. Baik suplemen maupun modifikasi prosedural dibahas dalam protokol dasar. MH agar dapat dibeli sebagai cawan agar disiapkan dari Remel (Overland Park, KS), BD BBL (Franklin Lakes, NJ), atau pemasok lain dari cawan agar disiapkan. Ikuti rekomendasi pabrik untuk penyimpanan piring disiapkan. MH agar-agar juga dapat disiapkan dari media dehidrasi tersedia dari perusahaan seperti Remel, BD BBL, atau pemasok media lainnya dehidrasi. Pastikan untuk mempersiapkan media sesuai dengan petunjuk produsen. Formula untuk Mueller-Hinton agar-agar per liter air dimurnikan (4)
Suspend komponen yang tercantum di atas dalam 1 liter air murni. Campur secara menyeluruh. Panas dengan agitasi sering dan didihkan selama 1 menit untuk benar-benar membubarkan komponen. Autoclave pada 121 ° C selama 15 menit. Dispense yang diinginkan. Memungkinkan untuk memperkuat pada suhu kamar, kemudian menyimpannya pada 4 sampai 8 ° C. Mueller-Hinton agar stabil selama kurang lebih 70 hari (per Remel Layanan Teknis, 1 September 2009) dari tanggal persiapan. Setiap laboratorium harus memverifikasi kualitas dan fungsi dari setiap batch media disiapkan dengan menguji strain yang dikenal organisme terhadap satu senyawa antimikroba yang digunakan sebagai 70-hari pendekatan tanggal kedaluwarsa. · Jika Anda mempersiapkan piring agar-agar MH dari media dehidrasi, piring harus dituangkan hingga kedalaman 4 mm (sekitar 25 ml agar-agar cair untuk 100-mm piring dan 60 ml agar-agar cair untuk 150-mm piring, tapi dengan syarat kasus dengan kedalaman diukur dari 4 mm). Pelat yang terlalu dangkal akan menghasilkan hasil yang rentan palsu sebagai senyawa antimikroba akan menyebar lebih jauh dari yang seharusnya, menciptakan zona inhibisi lebih besar. Sebaliknya, piring dituangkan untuk kedalaman> 4 mm akan menghasilkan hasil tahan palsu. · PH agar-agar MH harus jatuh antara 7,2 dan 7,4 pada suhu kamar setelah pemadatan dan harus diuji ketika media pertama disiapkan. Jika pH <7,2 obat-obatan tertentu akan muncul untuk kehilangan potensi (aminoglikosida, kuinolon, makrolid), sementara agen lain mungkin tampak memiliki aktivitas yang berlebihan (tetrasiklin). Jika pH> 7.4, hasil yang sebaliknya dapat terjadi. · Timidin berlebihan atau timin dapat membalikkan efek penghambatan sulfonamida dan trimetoprim yang dihasilkan di zona yang lebih kecil dan kurang jelas inhibisi, atau tidak ada zona sama sekali. · Konsentrasi salah kation divalen (kalsium dan magnesium) akan mempengaruhi hasil tes aminoglikosida dan tetrasiklin terhadap Pseudomonas aeruginosa. Kelebihan konsentrasi kation akan berukuran zona berkurang dan konsentrasi rendah akan meningkatkan ukuran zona. Kelebihan kalsium akan meningkatkan ukuran zona P. aeruginosa terhadap daptomycin. Kelebihan ion seng dapat mengurangi ukuran zona carbapenems terhadap P. aeruginosa. · MH agar-agar harus diuji dengan strain yang dikenal organisme setidaknya seminggu untuk memverifikasi bahwa media dan disk bekerja seperti yang diharapkan. Antibiotik kerentanan disk Disk antimikroba dapat dibeli dari satu pemasok terkemuka, seperti Remel atau BD BBL. Mereka yang dikemas dalam pegas cartridge berisi 25 atau 50 disk dan dapat dipesan sebagai kartrid individu atau dalam paket 10 kartrid. Penyimpanan yang benar dari disk ini sangat penting untuk hasil direproduksi. Cartridge disegel yang berisi disk kertas komersial disiapkan harus disimpan baik di 8 ° C atau dibekukan pada -14 ° C dalam freezer non-self-pencairan. Memungkinkan disk untuk datang ke suhu kamar sebelum melepas kemasan plastik pelindung. Setelah dibuka, simpan kartrid dalam pengering wadah penyimpanan yang mengandung tidak lebih dari 1 minggu. Dispenser disk yang semi-otomatis yang tersedia dari perusahaan seperti Remel dan BD BBL. Sadarilah bahwa disk cartridge dari satu perusahaan mungkin tidak sesuai dengan dispenser dari perusahaan lain. McFarland standar Standar McFarland adalah suspensi barium sulfat baik atau partikel lateks yang memungkinkan perbandingan visual dari kepadatan bakteri (Gambar 1). Standar komersial siap tersedia untuk pembelian dari perusahaan seperti Remel atau BD BBL. Ini sering menyertakan kartu Wickerham, yang merupakan kartu kecil yang berisi garis-garis hitam paralel. Sebuah standar McFarland 0,5 setara dengan suspensi bakteri yang mengandung antara 1 dan 2 x 108 x 108 CFU / ml E. coli. Sebuah standar McFarland 0,5 dapat dibuat di-rumah sebagai jelaskan di bawah. 1. Tambahkan alikuot 0,5-ml ml 0,048 mol / liter BaCl2 (1,175% berat / volume BaCl2 • 2H20) sebesar 99,5 dari 0,18 mol / liter H2SO4 (1% vol / vol) dengan pengadukan yang konstan untuk mempertahankan suspensi. 2. Verifikasi kepadatan yang benar dari standar kekeruhan dengan mengukur absorbansi dengan spektrofotometer dengan jalan cahaya 1-cm dan kuvet cocok. Absorbansi pada 625 nm harus 0,08-0,13 untuk 0,5 McFarland standar. 3. Transfer suspensi barium sulfat dalam 4 - untuk 6-ml aliquot ke sekrup-tutup tabung dengan ukuran yang sama dengan yang digunakan dalam standardisasi inokulum bakteri. 4. Ketat segel tabung dan menyimpan dalam gelap pada suhu kamar. Penggunaan standar McFarland dalam prosedur Kirby-Bauer. 1. Sebelum digunakan, dengan penuh semangat melakukan agitasi standar barium sulfat pada mixer vortex mekanik dan memeriksa untuk penampilan seragam keruh. Ganti standar jika partikel besar muncul. Jika menggunakan standar terdiri dari partikel lateks, campuran dengan membalik lembut, bukan pada mixer vortex. 2. Sebagai mahasiswa menambahkan koloni bakteri dengan larutan garam dalam "penyusunan inokulum" langkah prosedur, dia harus membandingkan suspensi yang dihasilkan dengan standar McFarland. Hal ini dilakukan dengan memegang kedua standar dan sisi tabung inokulum berdampingan dan tidak lebih dari 1 inci dari muka kartu Wickerham (dengan cahaya hadir cukup) dan membandingkan penampilan garis-garis melalui kedua suspensi. Jangan pegang tabung siram terhadap kartu. Jika suspensi bakteri muncul lebih ringan dari 0,5 McFarland standar, organisme lebih harus ditambahkan ke dalam tabung dari pelat budaya. Jika suspensi tampil lebih padat dari 0,5 McFarland standar, garam tambahan harus ditambahkan ke dalam tabung inokulum untuk mencairkan suspensi kepadatan yang sesuai. Dalam beberapa kasus mungkin lebih mudah untuk memulai kembali bukan untuk terus mencairkan suspensi bakteri yang terlalu padat untuk digunakan. 
Gambar. 1. McFarland standar (kiri ke kanan) 0,5, 1,0, 2,0, 3,0, diposisikan di depan kartu Wickerham. Standar McFarland digunakan untuk mempersiapkan suspensi bakteri ke kekeruhan ditentukan.
Dalam protokol Kirby-Bauer hard difusi kerentanan tes, suspensi bakteri
dari organisme yang akan diuji harus setara dengan 0,5 McFarland
standar.
PROTOKOL Persiapan Mueller-Hinton piring 1. Biarkan agar-agar MH piring (satu untuk setiap organisme yang akan diuji) untuk datang ke suhu kamar. Adalah lebih baik untuk memungkinkan piring untuk tetap berada di kantong plastik sementara mereka hangat untuk meminimalkan kondensasi. 2. Jika permukaan agar-agar memiliki cairan ini terlihat, mengatur piring terbalik, terbuka pada tutupnya untuk memungkinkan kelebihan cairan untuk menguras dari permukaan agar dan menguap. Pelat dapat ditempatkan dalam inkubator 35 ° C atau di kap aliran laminar pada suhu kamar sampai kering (biasanya 10 sampai 30 menit). 3. Tepat label setiap plate agar MH untuk setiap organisme yang akan diuji. Persiapan inokulum 1. Menggunakan loop inokulasi steril atau jarum, menyentuh empat atau lima koloni terisolasi dari organisme yang akan diuji. 2. Suspend organisme dalam 2 ml saline steril. 3. Vortex tabung garam untuk membuat suspensi halus. 4. Sesuaikan kekeruhan suspensi ini ke 0,5 McFarland standar dengan menambahkan organisme lebih jika suspensi terlalu terang atau menipiskan dengan garam steril jika suspensi terlalu berat. 5. Gunakan suspensi ini dalam waktu 15 menit persiapan. Tambahan Catatan Inokulum persiapan Organisme yang akan diuji harus dalam fase log pertumbuhan agar hasil yang akan berlaku. Disarankan bahwa subkultur organisme yang akan diuji dilakukan hari sebelumnya. Jangan gunakan ekstrem kepadatan inokulum. Jangan pernah menggunakan kultur kaldu murni semalam atau inokulum unstandardixed lain untuk inokulasi piring. Jika organisme sulit untuk menangguhkan langsung ke suspensi halus, metode pertumbuhan menyiapkan inokulum harus digunakan. Namun, organisme yang disarankan tercantum dalam prosedur ini semua menghasilkan suspensi halus dengan sedikit kesulitan. Lihat Laboratorium Clincial Standar dokumen Institute (3) untuk metode prosedur pertumbuhan untuk menyiapkan inokulum, jika diperlukan. Inokulasi dari pelat MH 1. Celupkan kapas steril ke dalam tabung inokulum. 2. Putar spons di sisi tabung (di atas permukaan cairan) dengan menggunakan tekanan kuat, untuk menghilangkan kelebihan cairan. Spons tidak boleh basah kuyup (Gbr. 2). 3. Menyuntik permukaan kering dari piring agar-agar MH oleh melesat tiga kali usap di atas permukaan agar-agar seluruh; memutar piring sekitar 60 derajat setiap kali untuk memastikan pemerataan inokulum (Gbr. 3). 4. Lingkar piring dengan swab untuk mengambil cairan berlebih (Gbr. 4). 5. Buang swab ke dalam wadah yang sesuai. 6. Meninggalkan tutupnya sedikit terbuka, memungkinkan piring untuk duduk pada suhu kamar minimal 3 sampai 5 menit, tapi tidak lebih dari 15 menit, untuk permukaan pelat agar-agar kering sebelum melanjutkan ke langkah berikutnya.  Gambar. 2. Kirby-Bauer hard difusi kerentanan tes protokol, inokulasi dari pelat uji. Langkah 2. Putar usap di sisi tabung sambil menerapkan tekanan untuk menghilangkan kelebihan cairan dari usap sebelum inokulasi piring.
Gambar. 3. Kirby-Bauer hard difusi kerentanan tes protokol, inokulasi plate agar Mueller-Hinton. Langkah 3. (A) menyuntik piring dengan organisme uji oleh melesat spons dalam gerakan back-dan-sebagainya sangat dekat bersama-sama saat Anda bergerak di seluruh dan ke bawah piring. Putar pelat 60 ° dan ulangi cara ini. Putar piring sekali lagi dan mengulangi tindakan melesat. Hal ini menjamin pemerataan inokulum yang akan menghasilkan rumput konfluen pertumbuhan. (B) Diagram menggambarkan pola spons harus mengikuti seperti yang digambarkan di piring.  Gambar. 4. Kirby-Bauer hard difusi kerentanan tes protokol, inokulasi plate agar Mueller-Hinton. Langkah 4. Setelah melesat dengan Mueller-Hinton piring agar-agar seperti yang dijelaskan pada Langkah 3, pelek piring dengan spons dengan menjalankan spons di sekitar tepi lempeng seluruh untuk mengambil setiap inokulum yang berlebihan yang mungkin telah memercikkan dekat tepi. Panah menunjukkan jalur spons. Penempatan disk antibiotik 1. Tempatkan disk antimikroba-diresapi yang sesuai pada permukaan agar-agar, baik menggunakan forsep untuk mengeluarkan setiap satu disk antimikroba pada satu waktu, atau dispenser multidisk untuk mengeluarkan beberapa disk sekaligus. (Lihat langkah-langkah a. Sampai d untuk penggunaan dispenser multi-disk atau e langkah.. Melalui g. Untuk penempatan disk individu dengan forsep. a. Untuk menggunakan dispenser multidisk, tempatkan piring MH agar-agar diinokulasi pada permukaan yang datar dan lepaskan tutup (Gbr. 5). b. Tempatkan dispenser atas piring agar dan tegas tekan plunger sekali untuk mengeluarkan disk ke permukaan piring. c. Angkat dispenser dari piring dan menggunakan forsep disterilkan dengan baik membersihkan mereka dengan pad alkohol atau menyala dengan isopropil alkohol, menyentuh setiap disk di atas piring untuk memastikan kontak yang lengkap dengan permukaan agar-agar. Hal ini harus dilakukan sebelum mengganti tutup cawan petri sebagai listrik statis dapat menyebabkan disk untuk merelokasi diri pada permukaan agar-agar atau mematuhi tutup (Gambar 6d). d. Jangan memindahkan disk setelah telah menghubungi permukaan agar-agar bahkan jika disk tidak di lokasi yang tepat, karena beberapa obat mulai menyebar segera setelah kontak dengan agar-agar. e. Untuk menambahkan disk satu per satu ke plate agar menggunakan tang, tempatkan piring MH pada template (Gbr. 7) disediakan dalam prosedur ini (Gambar 6a). Mensterilkan forseps dengan membersihkan dengan alkohol pad steril dan memungkinkan mereka untuk udara kering atau merendam dalam alkohol forsep kemudian memicu. f. Menggunakan tang hati-hati menghapus satu disk dari cartridge (Gambar 6b). g. Sebagian menghapus tutup cawan petri. Tempatkan disk pada piring di salah satu tempat yang gelap di template dan tekan dengan lembut disk dengan forsep untuk memastikan kontak yang lengkap dengan permukaan agar-agar. Ganti tutup untuk meminimalkan pemaparan dari permukaan agar-agar ke kamar udara (Gambar 6c, d). h. Lanjutkan untuk menempatkan satu disk pada suatu waktu pada permukaan agar-agar sampai semua disk telah ditempatkan sesuai petunjuk di f langkah. dan g. di atas. 2. Setelah semua disk berada di tempat, ganti tutupnya, membalikkan piring, dan menempatkan mereka dalam 35 ° C udara inkubator selama 16 sampai 18 jam. Ketika pengujian aureus terhadap oksasilin atau vankomisin, atau Enterococcus terhadap vankomisin, menetaskan selama 24 jam penuh sebelum membaca.
Gambar. 5. Kirby-Bauer hard difusi kerentanan tes protokol, penempatan disk antibiotik menggunakan dispenser disk yang otomatis. Langkah 1,. sampai d. Sebuah dispenser disk otomatis dapat digunakan untuk menempatkan beberapa disk secara bersamaan di piring agar-agar MH. () Set dispenser atas piring. (B) Tempatkan telapak tangan Anda di bagian atas pegangan. (C) Tekan dengan kuat dan benar-benar untuk mengeluarkan disk. Gagang musim semi dimuat akan kembali ke posisi semula ketika tekanan dihilangkan.
Gambar. 6. Kirby-Bauer hard difusi kerentanan tes protokol, penempatan disk antibiotik menggunakan tang secara manual menempatkan disk. Langkah 1, e. melalui jam. Disk antibiotik dapat secara manual ditempatkan pada pelat agar MH jika diinginkan. (A) Tempatkan plate agar Mueller Hinton-lebih template disk. (B) Hapus satu disk dari kartrid menggunakan tang yang telah disterilkan. (C) Angkat tutup piring dan menempatkan disk di atas salah satu tanda posisi. (D) Tekan disk dengan forsep untuk memastikan kontak yang lengkap dengan permukaan agar-agar. Ganti tutup pelat antara disk untuk meminimalkan paparan udara yang terbawa kontaminan. Tambahan Catatan Disk penempatan Disk tidak harus ditempatkan lebih dekat dari 24 mm (pusat ke pusat) pada pelat agar MH. Biasanya, tidak lebih dari 12 disk harus ditempatkan pada piring 150-mm atau lebih dari 5 disk di piring 100-mm. Namun, dispenser disk yang semi-otomatis memegang 16 dan 8 masing-masing disk dan tidak dapat mempertahankan pusat 24 mm direkomendasikan untuk jarak pusat. Template yang diberikan dalam protokol (Gbr. 7) mempertahankan pusat 24 mm direkomendasikan untuk jarak pusat dan memungkinkan penempatan hingga 8 disk di atas piring. Anda harus menghindari menempatkan disk dekat dengan pinggir piring sebagai zona tidak akan sepenuhnya bulat dan bisa sulit untuk diukur. Setiap disk harus ditekan ke bawah dengan forsep untuk memastikan kontak yang lengkap dengan permukaan agar-agar atau bentuk zona yang tidak teratur dapat terjadi. Jika permukaan agar-agar terganggu dengan cara apapun (disk menembus permukaan, garis terlihat hadir karena tekanan yang berlebihan spons terhadap piring selama inokulasi, dll) bentuk dari zona tersebut mungkin akan terpengaruh. Ketika mencetak template untuk digunakan dalam laboratorium mikrobiologi Anda, pastikan bahwa diameter lingkaran pada template adalah ukuran yang sama dengan Mueller-Hinton piring agar-agar yang Anda gunakan di lab (100 mm). The "mengurangi" atau "memperbesar" fungsi pada mesin fotokopi dapat digunakan untuk mengubah ukuran template jika diperlukan. Anda juga dapat membuat template Anda sendiri dengan menggambar lingkaran di sekitar piring agar-agar MH pada selembar kertas. Tambahkan penempatan menandai berdasarkan jumlah disk Anda berencana untuk menggunakan dalam sesi lab, menjaga jarak yang direkomendasikan seperti yang ditunjukkan di atas. Inkubasi pada pelat Berbagai suhu 35 ° C ± 2 ° C diperlukan. Perhatikan bahwa suhu di atas 35 ° C tidak memungkinkan deteksi methicillin-resistant Staphylococcus. Jangan menetaskan pelat di CO2 sebagai hal ini akan menurunkan pH agar-agar dan mengakibatkan kesalahan karena pH yang salah dari media. Hasil dapat dibaca setelah 18 jam inkubasi kecuali Anda menguji aureus terhadap oksasilin atau vankomisin, atau Enterococcus terhadap vankomisin. Baca hasil untuk disk antimikroba lain maka reincubate piring untuk total 24 jam sebelum melaporkan vankomisin atau oksasilin.  Gambar. 7. Disk yang manual penempatan template untuk delapan disk di piring 100-mm. Tempatkan piring agar-agar MH pada gambar di atas sehingga tepi garis piring dengan lingkaran luar. Buka tutupnya dari piring dan tempat satu disk antibiotik pada setiap lingkaran abu-abu gelap. Jika kurang dari delapan antibiotik digunakan, penyesuaian dapat dilakukan dengan jarak dari disk. Lihat "Catatan Tambahan" disk penempatan saran untuk mencetak template ini. Mengukur ukuran zona 1. Setelah inkubasi, mengukur ukuran zona ke milimeter terdekat dengan menggunakan penggaris atau kaliper; meliputi diameter disk dalam pengukuran (Gbr. 8, 9b). 2. Ketika mengukur diameter zona, selalu mengumpulkan ke milimeter berikutnya. 3. Semua pengukuran dilakukan dengan mata telanjang saat melihat bagian belakang cawan petri. Tahan pelat beberapa inci di atas permukaan, hitam nonreflecting diterangi dengan cahaya pantulan (Gambar 9a). 4. Lihat pelat menggunakan garis, vertikal langsung dari pandangan untuk menghindari paralaks yang dapat mengakibatkan salah baca. 5. Catat ukuran zona pada lembar perekaman. 6. Jika penempatan disk atau ukuran dari zona tersebut tidak memungkinkan Anda untuk membaca diameter ukuran, zona dari pusat dari disk ke titik pada keliling zona di mana tepi yang berbeda hadir (radius) dan kalikan hasil pengukuran 2 untuk menentukan diameter (Gbr. 10). 7. Pertumbuhan sampai ke tepi dari disk dapat dilaporkan sebagai zona dari 0 mm. 8. Organisme seperti Proteus mirabilis, yang berkerumun, harus diukur berbeda dari nonswarming organisme. Abaikan tabir tipis dipenuhi dan mengukur margin luar dalam zona dinyatakan jelas inhibisi. 9. Berbeda, koloni diskrit dalam sebuah zona inhibisi jelas tidak harus dianggap dipenuhi. Koloni ini baik organisme mutan yang lebih tahan terhadap obat yang sedang diuji, atau budaya itu tidak murni dan mereka adalah organisme yang berbeda. Jika ditentukan oleh pengujian ulangi bahwa fenomena berulang, organisme harus diperhatikan resisten terhadap obat itu. 
Gambar. 8. Mengukur zona inhibisi. Bayangan abu-abu merupakan rumput konfluen pertumbuhan bakteri.
Lingkaran putih melambangkan tidak ada pertumbuhan organisme uji.
Gambar. 9. Kirby-Bauer hard difusi kerentanan tes protokol, mengukur ukuran zona. (A)
Menggunakan penguasa atau caliper mengukur zona masing-masing dengan
mata telanjang saat melihat bagian belakang cawan petri. Tahan pelat beberapa inci di atas permukaan, hitam nonreflecting diterangi dengan cahaya yang dipantulkan. (B) Ukuran zona untuk kombinasi organisme-antibiotik adalah 26 mm.
 Gambar. 10. Kirby-Bauer hard difusi kerentanan tes protokol, mengukur ukuran zona; metode alternatif untuk mengukur zona. Jika zona disk antibiotik yang berdekatan tumpang tindih, diameter zona dapat ditentukan dengan mengukur radius zona. Ukur dari pusat dari disk antibiotik untuk sebuah titik pada lingkar dari zona mana tepi yang berbeda hadir. Kalikan pengukuran ini dengan 2 untuk menentukan diameter zona inhibisi. Dalam contoh ini, jari-jari dari zona tersebut adalah 16 mm. Kalikan pengukuran ini dengan 2 untuk menentukan ukuran zona dari 32 mm untuk kombinasi organisme-antibiotik. Mengukur ukuran zona Jika pelat itu benar diinokulasi dan semua kondisi lain itu benar, maka zona penghambatan harus seragam melingkar dan akan ada rumput konfluen pertumbuhan. Jika koloni individu yang jelas di piring, inokulum itu terlalu ringan dan tes harus diulang. Margin zona harus dipertimbangkan daerah tidak menunjukkan pertumbuhan, jelas terlihat yang dapat dideteksi dengan mata telanjang. Jangan gunakan perangkat pembesaran untuk mengamati tepi zona. Ketika mengukur zona penghambatan untuk organisme yang berkerumun (misalnya, Proteus sp.), Mengabaikan selubung tipis dipenuhi pertumbuhan di zona dinyatakan jelas inhibisi. Dengan trimetoprim dan sulfonamid, antagonis dalam medium memungkinkan beberapa pertumbuhan sedikit, sehingga mengabaikan pertumbuhan sedikit (20% atau kurang dari rumput pertumbuhan) dan mengukur margin lebih jelas untuk menentukan diameter zona (3). Interpretasi dan Pelaporan Hasil 1. Menggunakan pedoman CLSI diterbitkan, menentukan kerentanan atau ketahanan organisme untuk setiap obat yang diuji (Tabel 1, 2, 3). Perhatikan bahwa ada grafik yang berbeda untuk organisme yang berbeda. Disingkat grafik khusus untuk organisme penulis menyarankan dan disk antimikroba menggunakan yang disediakan di bawah. 2. Untuk masing-masing obat, menunjukkan pada lembar perekaman apakah ukuran zona rentan (S), menengah (I), atau resisten (R) berdasarkan peta interpretasi. 3. Hasil tes Kirby-Bauer difusi disk yang kerentanan dilaporkan hanya sebagai rentan, menengah, atau resisten. Ukuran zona tidak dilaporkan kepada dokter. Direkomendasikan antimikroba Disk dan Ukuran Zona Menginterpretasi (3) Ini adalah baterai yang disarankan disk untuk digunakan dalam pengaturan pendidikan karena meminimalkan antimikroba yang berbeda yang perlu dibeli untuk menguji ketiga kelompok organisme. Pendidik dapat memilih obat lain dari chart CLSI, yang sesuai untuk situasi mereka. Tabel 1. Zona diameter standar interpretatif untuk spesies Staphylococcus (3)  TABEL 2. Zona diameter standar interpretatif untuk Pseudomonas aeruginosa dan batang kecil lainnya nonfermenting gram negatif (3) 
Tabel 3. Zona diameter standar interpretatif untuk E. coli dan lainnya enterik gram negatif batang (3)
 KESELAMATAN American Society for Microbiology pendukung bahwa siswa harus berhasil menunjukkan kemampuan untuk menjelaskan dan mempraktekkan teknik laboratorium yang aman. Untuk informasi lebih lanjut, baca bagian laboratorium keselamatan Rekomendasi Kurikulum ASM: Kursus Pengantar Mikrobiologi dan Pedoman Keamanan Hayati di Laboratorium Pengajaran . |
No comments:
Post a Comment